CGmapTools: DNA甲基化数据分析和可视化工具

Date: 2017年9月25日
By: 朱平

DNA甲基化与亚硫酸盐测序

在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下，哺乳动物基因组上的胞嘧啶(C)第5位碳上会被加上一个甲基($-CH_3$)，我们称之为DNA甲基化，简称5mC。作为表观遗传学的重要组成之一，DNA甲基化在许多生物过程中都扮演着非常重要的角色，如抑制转座子的活性、调控基因的表达、维持基因组印记、参与X染色体的失活等。

目前，亚硫酸盐转化结合高通量测序(Bisulfite conversion + High throughput sequencing)是检测DNA甲基化信号的金标准。其主要原理是：亚硫酸盐能特异性的将DNA上没有甲基化的C转化成U，通过PCR扩增我们最终检测到的信号为T，但是有甲基化的C则不会被改变。因此，通过比较测序数据中C和T的比例，我们可以评估DNA甲基化的程度。

亚硫酸盐转化

随着测序成本的降低以及新技术方法的开发，DNA甲基化的研究越来越多，如何高效存储、共享、分析和可视化DNA甲基化数据成为我们亟需解决的问题。此前，已有一些针对DNA甲基化数据分析的工具被开发出来，涵盖质量控制、比对、找差异甲基化区域、预测SNP位点、Allele特异的甲基化等。尽管组合现有工具能够解决我们大部分的分析需求，但由于不同工具没有统一的输入／输出格式，给整合分析造成了较大困难，且部分工具的性能还有待较大提升。

CGmapTools显著提升BS-seq数据中计算杂合SNV的精准度，支持链特异DNA甲基化等40种分析及可视化

郭伟龙博士（中国农业大学）和朱平博士（天津血研所/北京大学）等人合作开发了DNA甲基化数据分析工具包：CGmapTools，包含40个独立的命令行工具，提供了全面的DNA甲基化数据分析和可视化功能。目前该工作已经在生物信息学著名期刊Bioinformatics上以original paper形式发表。

Weilong Guo #, Ping Zhu , et al. (2017), CGmapTools improves the precision of heterozygous SNV calls and supports allele-specific methylation detection and visualization in bisulfite-sequencing data, Bioinformatics, btx595.

CGmapTools的特色

CGmapTools示意图

1. 统一的数据格式

该工作提出将ATCGmap和CGmap文件格式作为存储DNA甲基化信息的标准格式。CGmapTools提供的大部分高级分析都基于这两类文件进行。统一的文件格式接口将打破数据格式的屏障，有助于DNA甲基化组学领域实现数据共享和互通。

目前，CGmapTools支持对BS-Seeker2生成的CGmap和ATCGmap文件直接分析；也支持将Bismark的比对结果（BAM文件）进行解读为CGmap和ATCGmap格式的文件，或对Bismark的甲基化信息格式转化为CGmap格式。

示例：

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# 从 BAM 格式生成 CGmap 格式文件
cgmaptools convert bam2cgmap -b WG.bam -g genome.fa --rmOverlap -o WG
# 将 Bismark 分析结果转换为 CGmap 格式
cgmaptools convert bismark2cgmap -i bismark.dat -o output.CGmap

2. 命令行模式轻松支持功能扩展

支持标准输入(STDIN)和输出(STDOUT)，轻松实现工具的多重组合。

示例：

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# 将多个CGmap文件合并为一个CGmap文件
cgmaptools merge2 cgmap -1 A.CGmap.gz -2 B.CGmap.gz | cgmaptools merge2 cgmap -1 C.CGmap.gz | cgmaptools merge2 cgmap -1 D.CGmap.gz -o ABCD.CGmap.gz
# 或者
cgmaptools mergelist tosingle -f cgmap -l A.CGmap.gz,B.CGmap.gz,C.CGmap.gz,D.CGmap.gz -o ABCD.CGmap.gz
# 将多个CGmap文件总结成为矩阵表格
zcat *.CGmap.gz  | gawk '$8>=5{print $1, $3}' | sort -u | cgmaptools sort -c 1 -p 2  -f A.CGmap.gz,B.CGmap.gz,C.CGmap.gz,D.CGmap.gz -t A,B,C,D -c 5 -C 100 -o matrix.CG.gz

3. 支持快速检索

在ATCGmap和CGmap文件基础之上，我开发了对应的二进制压缩文件格式ATCGbz和CGbz，可以快速检索指定基因组区域的DNA甲基化状态，同时在保留主要DNA甲基化组信息的同时，大大减少了硬盘存储的占用空间（例如，对于WGBS来说，BAM文件需50G，CGmap压缩格式需5.6G，CGbz格式只需3.9G）。

此功能受到了samtools view功能的启发。

示例：

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# 将 CGmap 转换为 CGbz
cgmaptools convert cgmap2cgbz -c in.CGmap.gz -b out.CGbz
# 从大文件中获得基因组上的局部甲基化信息
cgmaptools fetch cgbz -b input.CGbz -C chr1 -L 1010101 -R 2010256 | gzip > chr1_1010101_2010256.CGmap.gz

4. 优化差异甲基化区域分析

针对基因组覆盖度较低的全基因组甲基化测序数据(WGBS)和覆盖不连续的简化甲基化测序数据(RRBS)，该工作提出了动态片段化(dynamic fragment)的策略，实现数据的有效比较。

示例：

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# 计算 DMR
cgmaptools intersect -1 A.CGmap.gz -2 B.CGmap.gz | cgmaptools dmr -o DMR_A_vs_B.gz
# 计算 DMS
cgmaptools intersect -1 A.CGmap.gz -2 B.CGmap.gz | cgmaptools dms -o DMS_A_vs_B.gz

5. BS-Seq数据准确计算SNV新方法

利用ATCGmap文件的信息，通过引入wildcard的基因型，结合贝叶斯模型和二项分布模型设计了BayesWC和BinomWC两种SNV calling策略，使得从DNA甲基化数据计算heterozygous SNV的precision从之前80%提高到99%。

示例：

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# BayesWC模型
cgmaptools snv -i WG.ATCGmap.gz -m bayes -v bayes.vcf -o bayes.snv --bayes-dynamicP
# BinomWC模型
cgmaptools snv -i WG.ATCGmap.gz -m binom -o binom.snv

6. 支持Allele特异的甲基化分析和可视化

利用高精确度的杂合SNV作为输入，分析Allele-specific DNA methylation (ASM)，并通过Tanghulu(“糖葫芦”)图对ASM区域的读段上DNA甲基化的状态进行直观展示。

示例：

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# 利用预测的杂合SNV信息计算链特异的DNA甲基化（ASM）
gawk '{if(/^#/){print}else{print "chr"$0;}}' bayes.vcf > bayes2.vcf
cgmaptools asm -r genome.fa -b WG.bam -l bayes2.vcf > WG.asm

7. 提供多层次甲基化分析和可视化工具

支持基于不同水平的DNA甲基化分析和可视化，如不同C的类型(CpG、非CpG等）、不同基因组区域(如基因区域、启动子区域等）、不同窗口大小、不同样本等。

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# bin-wise DNA甲基化分析
cgmaptools mbin -h
# region-wise DNA甲基化分析
cgmaptools mfg -h
# site-wise DNA甲基化分析:“棒棒糖图”（lollipop plot）
cgmaptools lollipop -h
# read-wise DNA甲基化分析: “糖葫芦图” （tanghulu plot）
cgmaptools tanghulu -h
# sample-wise DNA甲基化分析:热图和聚类
cgmaptools heatmap -h
# context-wise DNA甲基化分析
cgmaptools mstat -h

##CGmapTools的安装
从CGmapTools的github主页上下载最新版本安装包，解压缩并安装。

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# decompress the gzip tarball
tar -zxf cgmaptools.X.X.X.tar.gz
# go to cgmaptool.X.X.X
cd cgmaptools.X.X.X
# install
sh ./install.sh

CGmapTools充分利用了DNA甲基化数据的特性（即同时包含甲基化和基因组序列信息），从多组学角度提供了针对不同生物问题的分析功能。以下介绍CGmapTools在不同生物问题分析中的应用示例。

更多使用方法，可参考CGmapTools的网上教程。